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Zellbasierte Kinase-Screening/Profiling Assay-Services
Zellbasierte Assays sind für ein sekundäres Screening nützlich, da sie die Bindung, Selektivität und Affinität in einer Umgebung testen die mehr der Realität entspricht. Einige Wirkstoffkandidaten haben sich in einem biochemischen Assay als wirksam erwiesen, versagen jedoch bei nachfolgenden Tests in zellbasierten Assays. Noch überraschender sind Verbindungen, die nach dem Scheitern in biochemischen Tests fast verworfen worden wären, aber in der Zelle Wirksamkeit zeigten.
In Zusammenarbeit mit Carna Biosciences und Advanced Cellular Dynamics bieten wir zelluläre Kinase-Assays zur Bewertung der Wirksamkeit und Selektivität Ihrer Wirkstoffe an. Unsere Assays umfassen ein Tyrosinkinase-Assay-Panel und einen zellulären Phosphorylierungs-Assay, der sowohl für Tyrosin- als auch für Serin/Threonin-Kinasen geeignet ist.
NanoBRET™ TE Intrazellulärer Kinase-Assay (HEK293-Zellen)
Untersuchung der Bindung und Verweildauer von Inhibitoren in intakten Zellen, die humane Kinasen in voller Länge exprimieren
Die Quantifizierung der Bindung, Selektivität und Affinität von Kinaseinhibitoren in der zellulären Umgebung, in der sie natürlicherweise wirken, ist von entscheidender Bedeutung für eine genauere Vorhersage ihrer Wirksamkeit gegenüber humanen Kinasen. Mit dem NanoBRET™ Target Engagement Intracellular Kinase Assay System (Promega) können Sie das Engagement Ihrer Substanz für ein ausgewähltes intrazelluläres Target unter physiologischen Bedingungen bewerten, einschließlich der Verweildauer der Substanz am Target, während die Zellen intakt bleiben. Der NanoBRET™ Assay Service wird von Carna Biosciences angeboten und durchgeführt, während Kinase Logistics als Distributor fungiert. Senden Sie uns einfach Ihre gewünschte(n) Substanz(en), und Carna wird Ihnen in kürzester Zeit die zellulären IC50-Werte und die Residenzzeit liefern!
Dieser Proximity-basierte Assay detektiert molekulare Interaktionen in lebenden Zellen durch Messung des Energietransfers von einem biolumineszenten Protein-Donor (NanoLuc®-Luciferase) zu einer fluoreszierenden Sonde (NanoBRET™-Tracer). Der NanoBRET™ TE Assay misst die scheinbare Affinität von Testverbindungen durch kompetitive Verdrängung des NanoBRET™-Tracers, der reversibel an ein in lebenden Zellen exprimiertes NanoLuc®-Luciferase-Kinase-Fusionsprotein gebunden ist. Ein zellpermeabler fluoreszierender NanoBRET™-Tracer, ein BRET-Akzeptor, wird HEK293-Zellen zugesetzt, die ein Kinase/NanoLuc®-Fusionsprotein in voller Länge exprimieren. Die Bindung des Tracers an das Zielprotein erzeugt ein BRET-Signal. Die Bindung der Testverbindung an das Zielprotein führt zu einem Verlust des BRET-Signals zwischen dem Zielprotein und dem Tracer in intakten Zellen.
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Panel Services
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Zellbasierte Tyrosinkinase-Assays (BA/F3-Zellen) IC50-Bestimmung / %-Hemmungsstudie
In Zusammenarbeit mit Advanced Cellular Dynamics (ACD, Seattle, WA, USA) bieten wir ein einzigartiges zellbasiertes Tyrosinkinase-Assay-Panel an. Dieser Service bietet Tyrosinkinase-Profiling/Screening unter Verwendung von Transfektanten, in denen aktivierte rekombinante Kinasen exprimiert werden, und kann Ihnen helfen, direkte Inhibitoren für Ziel-Tyrosinkinasen zu entdecken.
Der Assay beruht auf konstitutiv aktivierten Kinasen, die der IL3-unabhängigen Ba/F3 (Pro-B)-Zelllinie ein zytokinunabhängiges Wachstum ermöglichen. Die Zellen werden durch Induktion von Zielgenen über virale Vektoren transformiert. Die Aktivität der transformierten Kinase setzt die IL-3-Abhängigkeit für die Zellproliferation und das Überleben außer Kraft. Wenn der Kinaseinhibitor die Aktivität der rekombinanten Kinase spezifisch blockiert, durchlaufen die veränderten Zellen den programmierten Zelltod (Apoptose), was zu einer geringeren Messung von Rest-ATP führt.
Zwei Optionen für die Bewertung von Aktivität und Potenz
- IC₅₀-Bestimmungen: zehn (10) serielle Konzentrationen (9 halblogarithmische Verdünnungen) werden in Doppelbestimmung getestet
- %-Hemmstudie: drei (3) serielle Konzentrationen (2 Full-log-Verdünnungen) in Doppelbestimmung
Größtes kommerziell verfügbares zellbasiertes Tyrosinkinase-Panel
Wählen Sie Ihre Targets aus dem umfassenden Tyrosinkinase-Panel und ACD wir %-Inhibitions- oder IC₅₀-Studien mit Ihren Verbindungen und klinisch relevanten Kinaseinhibitoren für Sie durchführen.
Zusätzlich zu den Screening-/Profiling-Dienstleistungen ist auch die Bereitstellung von Zelllinien möglich. Für die detaillierten Bereitstellungsbedingungen nehmen Sie bitte Kontakt mit uns auf.
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Assay zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
Unser Split Luciferase Complementation Assay, bei dem eine einzigartige Luciferase aus Pyrearinus termitilluminans (Emerald Luciferase, E-Luc) verwendet wird, ist ein wertvolles Instrument für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI). Damit lassen sich verschiedene Arten von PPI, einschließlich GPCRs, einfach und mit hoher Empfindlichkeit nachweisen. Zusätzlich zu den etablierten Zelllinien auf der Liste entwickeln wir kundenspezifische stabile transfizierte Zelllinien, die für den Nachweis spezifischer PPIs von Interesse sind! Alle Zelllinien sind nach Eingang Ihrer Bestellung und unserer Qualitätsprüfung sofort versandbereit. Wir entwickeln auch transfizierte Zelllinien, die sich für kundenspezifische Assays eignen. Das Zellassay-Reagenz (Split Glow) ist bei jedem Kauf einer stabilen Zelllinie enthalten.
Split-Luciferase-Technologie
E-Luc ist dafür bekannt, dass es ein helleres und stabileres Signal aussendet als herkömmliche Glühwürmchen-Luciferasen. Die N- und C-terminalen Domänen der Luziferase können in zwei Fragmente aufgespalten werden, die sich in den Zellen neu assoziieren können. Bringt man diese beiden Fragmente der fusionierten Reporterproteine in die Nähe, falten sie sich spontan wieder zusammen und erzeugen ein nachweisbares Signal (Patent angemeldet).
Anwendung für GPCR
Die N-terminalen und C-terminalen Fragmente der gespaltenen Luziferase sind mit β-Arrestin bzw. GPCR fusioniert. Die Bindung eines Liganden an den GPCR löst eine Phosphorylierung des GPCR aus und induziert dadurch seine Interaktion mit β-Arrestin. Diese Wechselwirkung bringt die N-terminale Luziferase in die Nähe der C-terminalen Luziferase, und die Biolumineszenzaktivität ist messbar.
Auf Anfrage können wir transfizierte Zelllinien entwickeln, die nicht in der Liste der stabilen Zelllinien aufgeführt sind.
Kundenspezifische RAF-Dimerisierungs-Assay-Dienste
Die Auswirkungen Ihrer Wirkstoffe auf eine oder alle der fünf Isoform-Paare BRAF/BRAF, BRAF/BRAF[V600E], CRAF/BRAF, CRAF/BRAF[V600E], CRAF/CRAF können jetzt mit unserem RAF-Dimerisierungs-Assay untersucht werden, der individuell auf Ihre Untersuchung zugeschnitten ist. Die Bewertung der durch einen Inhibitor geförderten RAF-Dimerisierung liefert Anhaltspunkte für das Verständnis des Mechanismus der durch den Inhibitor induzierten Dimerisierung. Es ist auch möglich, die hemmende Aktivität Ihrer Verbindungen in einem Assay zu quantifizieren, bei dem die RAF-Dimerisierung durch einen Liganden induziert wird.
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